卵黄血小板及油球的特点

早期发育所需的营养先以YGs或血小板及油球的形式积累。在硬骨鱼类卵母细胞后期发育中，卵黄由圆形或椭圆形卵黄小板组成，这些卵黄小板的大小随卵的不同而不同，在较大的卵中，卵黄小板也较大；同一个卵中，卵黄小板也会有所不同，位于中心位置附近的卵黄小板相对更大，也比表面的卵黄小板同质性更高。卵黄小板包含两个区域：包围卵黄小板的膜和一个中央核。外部的鞘由黏多糖和异源三聚体G蛋白组成。内部区域包含卵黄脂磷蛋白（Lx）和Pv，或类似的脂蛋白和磷蛋白。卵黄可能被隔绝在卵中心一个膜里面，如青鳉、爪哇青鳙；或可能与卵质一起混入，如斑马鱼。卵黄囊通常是鱼卵卵黄的主要成分。尽管动物世界的卵黄小板大小各有不同，从线虫类秀丽隐杆线虫YGs的1μm宽到鸡蛋卵黄的140μm，卵黄囊似乎是与进化相应的细胞器。与其他大部分淡水鱼相反，河鲈卵黄似乎完全同种，没有囊泡形成也没有卵黄小板。

不同鱼的油球大小、外观和数目均不同。在居于水底或胎生鱼卵卵黄囊中，存在大量直径为1μm的小油球（金头鲷；梭子鱼）；河鲈、青鳓及其他多种鱼类，散布在卵母细胞内部的许多小油球在受精之后与一个靠近卵上部的大油球融合。石首鱼在受精之后，存在大量油球，它们在孵化之前常结合成一个，其他海鱼则有很多油球。与此相对照的是，也有不含油球的深海鱼卵（例如鳕形、鲽形目、美洲拟鳜、大西洋庸鲽）。

鱼类卵黄多核层（ysl）的结构与多样性

硬骨鱼的不完全卵裂形成胚外卵黄囊。卵黄囊最主要的功能是为发育的胚胎和仔稚鱼提供营养，另外还有气体交换与排泄作用。卵黄囊最典型的特征是卵黄多核层（ysl）。

Ysl来自于卵裂早期收缩的边缘分裂球，并在卵黄细胞和内部细胞团块（ICM）之间形成多核体，后者是胚胎前体。研究指出，硬骨鱼类早期生活史中的ys也被视为胚盘外包的主要动力。 广泛认为，表胚层”中线粒体的高频出现，是它作为外包驱动力的证明。早期胚胎发育中，前神经组织的诱导和体轴腹外侧中胚层的形成，以及腹外侧边缘分裂球的节-相关非基因的诱导，都归功于ysl表达基因的控制。Ysl的功能与组织上皮的形态发生、心脏组织形态发生以及肝脏芽的形成有关。

在硬骨鱼胚胎中，ysl连同中胚层及外胚层围绕整个卵黄块分布。与非硬骨鱼类半斑目、弓鳍目、鲟目和其他一些较低级的脊椎动物相反，在胚胎和早期仔稚鱼“卵黄囊幼鱼”发育时期，硬骨鱼内胚层和卵黄储备之间并没有关系。卵黄流通有专门的静脉血管，在卵黄囊的壁中发育。通常，在肝脏入口系统形成卵黄，肠道前体血管和血管网状组织作为肝静脉的一部分。在硬骨鱼胚胎和仔稚鱼中，所有从机体发出的较大血管为卵黄囊提供血液。然而，许多物种，如金头鲷、黑鲈、梭鲈（白梭吻鲈）或大比目鱼（大菱鲆），在早期发育阶段并不具有卵黄囊循环。最近有关狼鲈（条纹鲈）仔稚鱼的研究结果，与在海鲷、黑鲈、梭鲈和大比目鱼中报道的结果一致。在孵化后1天、3天，狼鲈仔稚鱼卵黄囊中未发现血管。 总结认为，大比目鱼卵黄囊中缺少血液循环系统，但并不妨碍从卵黄细胞到胚胎发育，或仔稚鱼的营养吸收和转移。

卵黄囊储备的大部分营养需通过ys/yt到达胚胎及仔稚鱼组织，在此过程中，apoE基因的表达必不可少。已有科研人员研究了内源营养的细胞学基础，尤其是硬骨鱼胚胎及仔稚鱼/初孵鱼苗中卵黄储备物的利用。迄今为止，大多数研究已经确定了卵黄利用在硬骨鱼发育中的作用。

棕鳟（亚东鲑鱼）的ysl结构在孵化之后很快在细胞质区域（ycz）组成。Ysl细胞质区域的细胞器与鲑鱼初孵鱼苗、大西洋庸鲽及梭鲈仔稚鱼以及狼鲈类似。Ycz是一个相当复杂的结构，涉及卵黄水解、脂蛋白微粒合成及将它们运送至卵黄的循环。Ycz包含平面和粗面内质网、大量线粒体及高尔基体复合物。所有这些部分延伸穿过Ycz的细胞器，能形成分层结构。然而，一些鱼类尽管存在细胞器，但似乎并不含分层的“表胚层”，如大西洋鳕鱼、大西洋庸鲽、海鲷、海鲈、碧古鱼及白鲈。

卵黄小板和卵黄颗粒的结构及降解

ysl/ytl在蛋白质从卵黄细胞运输至胚胎和仔稚鱼的过程中扮演着重要角色。蛋白质水解发生在卵黄合胞层（ysl）的卵黄血小板。由于卵黄囊自身含有水解酶，因此，在ysl发生卵黄血小板的蛋白质水解。虹鳟胚胎中有两种酶含量不同的卵黄血小板。一种是有酶的能在ysl形成之前使营养得以释放。第二种或是常见的缺乏这种酶的卵黄血小板类型，并被ysl结构酶消化。有人推断，有光面内质网和大量线粒体的ysl区域及丰富的糖原颗粒会负责碳水化合物和脂质的代谢。第二个区域的特点是具有粗面内质网和高尔基体复合物，它与蛋白质合成和运输有关。卵黄磷蛋白脱去磷酸，通过钙依赖性活性磷酸酯酶变成可溶。合胞体的高尔基体复合物可能为卵黄血小板的降解提供酸水解酶。

在特定胚胎发育阶段，YGs才分解自身，尽管它们已经形成了好几个星期。这与溶酶体能快速把几乎任何蛋白质分解成游离氨基酸、糖及其他小分子化合物相反。卵黄血小板最初是在河鲈桑葚胚阶段的ysl中被发现。pH及酶对YG激活和卵黄利用调控起重要作用。YGs能调节它们的pH；初始pH是中性或微酸性，随胚胎发育逐渐酸化，并引起卵黄降解。

卵黄蛋白质和氨基酸的利用

卵黄蛋白质来自VtgA，完全分裂产生氨基酸。这种模式是通过分析斑马鱼胚胎和成鱼组织及鲚鱼胚胎中ctlsa、 ctlsb及ctlsc基因表达得以识别。在鳞鱼中，组织蛋白酶原L（Ctsl）异构体最可能涉及卵黄蛋白质水解。天冬氨酸蛋白酶组织蛋白酶D（Csd）的活动似乎通常涉及脊椎动物卵黄蛋白质的降解，尤其是在斑马鱼胚胎和仔稚鱼中。位于ysl的酶原Ctsl被转移到卵黄球，从中心卵黄块分离，它被卵黄球中的Ctsd激活成组织蛋白酶L，后者水解卵黄蛋白质。卵黄基质中的几种酶是弱阳性的，其中包括碱性和酸性磷酸酶、ATP酶、葡萄糖6磷酸及胰蛋白酶。

尽管新受精的卵中游离氨基酸组成相似，但对许多深海鱼卵来说，并无卵黄中必需氨基酸或非必需氨基酸合成蛋白质的速率的相关规律。如条斑星鲽和大西洋庸鳜对EAA和NEAA的利用不同，而比目鱼对EAA及NEAA并不存在选择性利用。游离氨基酸的动员，主要发生在大菱鲆孵化之前及孵化之后的短时间内，还有檬鲽胚胎及早期卵黄囊仔稚鱼之中，或是大西洋庸鲽等的卵黄囊仔稚鱼中。对黑鲈来说，孵化之前（18℃）就耗掉了大约60%游离氨基酸，而来自油球的中性脂质似乎成为孵化后的主要能源基质。狭鳕的游离氨基酸直至孵化才被利用，大概是在受精后17天；而来自VtgB磷脂和三酰基甘油的Lv的高度利用，发生在仔稚鱼期间，即5℃下受精后的18-28天条斑星鲽胚胎（受精后0~10天，8℃）及卵黄囊仔稚鱼（11-21日龄）对卵黄营养的利用，存在一个三相序列。它具有一个明显模式：0-4天不利用游离氨基酸，游离氨基酸的损耗主要发生在4天以后，13天时仅剩13%初始游离氨基酸。

Lv和磷脂通常在受精16-21天后开始被利用。在大西洋鳕鱼胚胎发育期间，75%能量来自游离氨基酸新陈代谢，13%来自极性脂质，9%来自三酰基甘油。孵化后，能量利用如下：游离氨基酸2%；极性脂质20%（主要是PC）；中性脂质17%；蛋白质31%。这使得67%氨基酸和32%脂质被全利用。在大菱鲆中，深海鱼卵类有一个单独油球胚胎分解代谢和内源营养仔稚鱼由氨基酸（50%，来自游离和结合蛋白质几乎各占一半）和脂质（50%，主要是中性脂质）供能。同样，游离氨基酸（84%）是大菱鲆胚胎发育过程中主要的新陈代谢能源。孵化之后，蜡酯（33%）和三酰基甘油（25%）是重要能源，与此同时，仅10%游离氨基酸得以利用。对孵化后12天期间的大西洋庸鲽卵黄囊仔稚鱼而言，卵黄中超过70%游离氨基酸被利用，而卵黄蛋白质却没有明显变化。这表明：当游离氨基酸作为孵化后卵黄吸收期间的优势能源基质时，大西洋庸蝶仔稚鱼能持续利用内源储备物。其次，其他氨基酸则来自卵黄蛋白质；孵化时，60%总氨基酸（游离的及蛋白质氨基酸）作为鱼体蛋白质合成的前体，而剩下40%则作为仔稚鱼能量代谢基质。

根据大量在海水鱼类中的研究结果可看出，在个体发育的内源营养阶段，相对于结合在卵黄蛋白质中的氨基酸而言，游离氨基酸被较早动员（内源及新孵化的仔稚鱼）。

通过免疫注射产蛋鸡，即可由其生产的蛋黄中提取相应的抗体，并可用于相应疾病的预防和治疗，这类制剂称为卵黄抗体。卵黄抗体在临床上应用较为广泛，其优点是鸡蛋比动物血清更容易获得，且卵黄中抗体含量较高。禽类的免疫器官法氏囊主要控制机体的体液免疫，机体的免疫应答发生后，体液中成熟的骨髓依赖性淋巴细胞受相关免疫信号通路的介导，分化为浆细胞，随即产生大量抗体释放入血液中。血液中的大量抗体逐渐转移入卵黄中，并适量地蓄积。收集到的卵黄抗体，即为通过同一抗原反复刺激后产生的多克隆抗体。卵黄中主要的免疫球蛋白为IgY，其功能与作用类似于哺乳动物血清中的IgG。鸡lgY的分子量约180k Da，由两条轻链和两条重链组成，分子量分别为60~70k Da和22~30k Da，等电点约为5.2。IgY具有较强的耐热、耐酸、抗离子强度和一定的抗酶解能力。

卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪，其比例为1:2。大部分蛋白质都是脂蛋白，存在于卵黄颗粒中，不溶于水，只有卵黄球蛋白（α、β、γ）是水溶性的，而IgY是γ卵黄球蛋白。因此lgY的分离纯化首先需要有效地去除卵黄中的脂类，从水溶性蛋白中分离IgY。目前已建立了诸如PEG、硫酸葡聚糖、天然胶，如海藻酸钠、角叉聚糖或乙醇沉淀等方法初步纯化蛋白质。

1.健康产蛋鸡（最好是SPF鸡）、免疫抗原（如鸡新城疫灭活疫苗）、弗氏佐剂。

2.灭菌生理盐水或0.01mol/L pH7.2 PBS、海藻酸钠、饱和硫酸铵等。

3.毛细滴管、注射器、碘酊棉、酒精棉、烧杯、玻璃棒、离心管、pH试纸等。

4.微量振荡器、离心机、分光光度计等。

1.实验动物的选择：选择健康、产蛋率高的蛋鸡，购进后饲养1周左右，观察其健康情况。

2.抗原的准备：免疫抗原有多种选择，一般采用灭活的病原体，也可以选择激素类、蛋白类物质，使用前可以选用弗氏完全佐剂乳化抗原。

3.动物免疫：免疫方式主要有口鼻接种、皮内接种、皮下接种、肌肉注射、腹腔注射以及静脉注射。禽类的免疫方式多用肌肉注射，接种中采用胸肌多点注射。使用弗氏完全佐剂充分乳化抗原。以商用鸡新城疫灭活苗免疫为例，首次免疫的剂量可以控制在1~2 mL，抗原含量为0.3-0.5 mg/kg（30日龄的蛋鸡免疫剂量为0.4 mg/次）2周后进行2次免疫，4周后第3次免疫之后每隔1个月可加强免疫1次。

4.免疫鸡血清抗体效价检测：一般使用琼脂免疫扩散实验检测免疫鸡血清中的抗体效价。将免疫蛋鸡所用的抗原滴加于抗原孔，免疫鸡血清滴加于抗体孔。抗原孔与抗体孔之间出现沉淀线者，为阳性。最高稀释倍数血清孔出现沉淀线，即为该血清的抗体效价。一般效价达到1:64以上时，可开始收集免疫蛋鸡所产鸡蛋。

5.收集卵黄抗体：先用清洁水洗去蛋壳表面的粪污，再使用碘酊和酒精消毒。无菌条件下打开胚壳，倾出蛋黄至灭菌大烧杯中，以1:9的比例加入灭菌生理盐水或0.01 mol/L pH7.2 PBS稀释并充分混匀，调节pH至5.2，匀浆后的卵黄抗体可以进一步提纯，也可加入0.01%硫柳汞或每毫升卵黄液加入青霉素、链霉素各1000单位进行防腐抑菌，摇匀后分装于消毒好的瓶中，冷冻干燥保存或制成干粉利用。

6.IgY的纯化：卵黄混合液反复冻融3次，6000 r/min离心30 min，分离出卵黄蛋白，加入终浓度0.07%的海藻酸钠和0.02%的NaCl，振荡，使海藻酸钠充分溶解，静置30 min，6000 r/min离心30 min，上清液调节pH到7.2，再依次用50%、33%、3%的饱和硫酸铵（pH 7.2）提取IgY，用 SephadexG-25脱盐。

对获得的卵黄抗体进行的效价及活性测定，可采用免疫电泳实验、琼脂免疫扩散实验、血凝抑制实验、酶联免疫吸附实验等多种抗体检测方法。